El objetivo general es avanzar en el conocimiento de la regulación fina de la función y localización celular de los receptores acoplados a proteínas G. Los receptores con los que se trabaja son: alfa-1-adrenérgicos (tres subtipos, i.e., A, B y D), receptores para el ácido lisofosfatídico (tres subtipos LPA1-3), el receptor S1P1 de la esfingosina 1-fosfato y los receptores para ácidos grasos libres FFA1 y FFA4. Todos estos receptores son intrínsecamente importantes dada su participación en la fisiología normal y en la fisiopatología de diversas enfermedades humanas. Dentro de este objetivo general quedan incluidos otros, como son: a) el conocer lo sitios que se fosforilan in cellulo y su relevancia en la función, b) conocer las proteínas cinasas y fosfatasas que regulan dichas fosforilaciones, c) determinar el impacto funcional de los sitios o grupos de sitios (""clusters""), d) conocer otras proteínas que participan en la formación de los complejos de señalización y su participación en el destino celular (internalización, reciclaje a la membrana plasmática o canalización para su destrucción). En este último punto hemos limitado el estudio a las proteínas Rab.
METAS
1.1) Receptor alfa-1A-adrenérgico. a) Se continuará estudiado la interacción del receptor alfa-1A con algunas proteínas Rab, se ha observado asociación diferencial por distintos agonistas y con la activación farmacológica de la proteína cinasa C. b) Se plantea iniciar la caracterización de los sitios detectados como fosforilados en el carboxilo terminal realizando mutaciones puntuales o por grupos (""clusters"") para conocer su relevancia. Se valorará su repercusión funcional (calcio intracelular, fosforilación de ERK 1/2) y la localización del receptor en condiciones basales y estimuladas.
1.2) Receptor alfa-1B-adrenérgico. a) Se plantea realizar la caracterización de los sitios fosforilados ya publicados por nosotros realizando mutaciones puntuales o por grupos (""clusters"") para conocer su relevancia (estrategia similar a la mencionada en el punto (1.1b).
1.3) Receptor alfa-1D-adrenérgico. a) Se identificó un grupo de sitios que se fosforilan (denominado por nosotros como ""cluster distal) y que cuando se substituyen por amino ácidos no fosforilables hacen que el receptor se integre muy pobremente a la membrana plasmática [15]. En contraste, la sustitución por aspártico permite la incorporación o permanencia del receptor en la membrana plasmática [15]. Se pretende definir si es uno o son varios de los amino ácidos los responsables y qué proteína cinasa(s) es(son) la que cataliza(n) el proceso.
2) Receptores para ácido lisofosfatídico. a) Se continuará el estudio de la interacción del receptor LPA1 con diversas proteínas Rab. b) Sabemos que los tres receptores de nuestro interés (LPA1-3) se fosforilan y desensibilizan. Hemos podido ya obtener por espectrometría de masas evidencia de algunos sitios fosforilados en el receptor LPA3; se continuará este proyecto
3) Receptor S1P1 para esfingosina-1-fosfato. Como parte del estudio hemos realizado el análisis de los sitios fosforilados, confirmando algunos ya reportados. Además, encontramos algunos sitios aún no reportados y se está trabajando en la obtención de mutantes (no fosforilables y fosfomiméticas) para intentar definir su importancia funcional
4) Receptores para ácidos grasos a) Se está realizando el estudio de la interacción del receptor FFA4 con las proteínas Rab durante la internalización y se propone continuarlo. b) El estudio de los sitios fosforilados en el receptor FFA1 (GPR40) no logró avances significativos con múltiples análisis por espectrometría de masas realizados. Por ello, se hizo el análisis in silico de los sitios probables de ser fosforilados y se generaron las mutantes correspondientes. Se continuará el trabajo que muestra que modificaciones en los sitios tanto del carboxilo terminal como de la tercera asa intracelular repercuten en la fosforilación del receptor, curiosamente poco en su capacidad para incrementar el calcio libre intracelular pero en forma muy importante para activar ERK1/2.
El trabajo realizado en el laboratorio durante los últimos casi 40 años ha resultado productivo y ha tenido impacto. Pero más allá de consideraciones cuantitativas, la relevancia del trabajo que hemos realizado se refleja en su citación en múltiples libros de texto clásicos del área biomédica (por ejemplo el Williams de Endocrinología o el Goodman and Gilman’s de Farmacología, en varias de sus ediciones).
De los receptores acoplados a proteínas G, los receptores mejor estudiados desde el punto de vista estructural son la rodopsina y el receptor beta-2-adrenérgico (el trabajo sobre la estructura de este último por Brian Kobilka fue la pieza cardinal para que se le otorgara el Premio Nobel en Química). Desde el punto de vista de su regulación/ desensibilización homóloga los mejor estudiados son los beta-adrenérgicos y los de dopamina. Estas contribuciones han sido hechas por diversos grupos entre los que destacan el de Robert Lefkowitz (recipiendario también del Premio Nobel en Química) y el de Marc Caron. En el caso de la regulación/ desensibilización heteróloga, considero que los mejor estudiados son los receptores alfa-1-adrenérgicos, por diversos grupos incluyendo a mi laboratorio. Es importante también señalar que “transducción de señales” era, hace 20 o 30 años, una pequeña área de investigación y que se ha ido convirtiendo en un punto donde convergen intereses de diversas disciplinas: bioquímica, biología molecular, fisiología, farmacología, biología celular, etc.
El proyecto se enmarca en la idea general de que el proceso de regulación de la sensibilidad de los receptores de este tipo (desensibilización/ resensibilización) incluye diversos procesos en las escalas espacial y temporal. Uno de los eventos iniciales es la fosforilación de los receptores en la que hemos trabajado más de diez años y continuamos haciéndolo. Dicha fosforilación implica cambios conformacionales del receptor, activación de cinasas y asociación del receptor con diversas proteínas. Esto es, la formación de complejos multimoleculares de señalización y que parece tener una gran relevancia tanto en la propagación como en el apagamiento de la señal y en el destino celular del receptor (es decir su internalización y destrucción o reciclaje a la membrana). En este direccionamiento las GTPasas Rab juegan un papel fundamental. El esfuerzo fundamental del trabajo se centra en: definir molecularmente dónde se fosforilan los receptores y conocer su repercusión funcional, relacionar estos eventos con la internalización de los receptores que se estudian (qué define que se internalice, hacia qué compartimento, cómo se define la disyuntiva degradación/ reciclaje). Además, en los últimos años nos hemos adentrado en el estudio de la farmacodinamia de los agentes que se unen al receptor, es decir, lograr definir cuáles son agonistas generales, agonistas sesgados, antagonistas clásicos, agonistas inversos, etc. [véanse los libros de textos de Terry Kenakin]. El proyecto se encuentra tecnológica y conceptualmente en lo que denominaría el “estado del arte” de la investigación en el área. Con el apoyo de la DGAPA-PAPIIT esperamos poder seguir avanzando en el área. Confío en que durante el desarrollo del proyecto y como consecuencia de las investigaciones se logre publicar por lo menos un artículo de calidad internacional por año y se pueda culminar la formación de los estudiantes de pregrado y posgrado. Es importante señalar la incertidumbre ante la pandemia y el apoyo del CONACYT. Si estos dos aspectos tienen una solución positiva, podremos incorporar nuevos estudiantes y amplificar el avance y los productos concretos al nivel que hemos tenido en los últimos años.