La mayoría de las plantas terrestres, incluidas las monocotiledóneas como el arroz, pueden formar simbiosis con los hongos micorrícicos arbusculares (AM), que ayudan a las plantas huésped a absorber y transportar fósforo, nitrógeno y agua del suelo. A cambio, la planta huésped alimenta a los hongos con lípidos y carbono fotosintético. En condiciones de bajo fosfato, las raíces del huésped sintetizan y exudan estrigolactonas, en respuesta los hongos AM secretan factores Myc (lipo-quitooligosacáridos). La señal del factor Myc pasa a través de una cascada de genes vegetales necesarios para el desarrollo de AM llamada ""vía de señalización simbiótica común"" (CSSP por sus siglas en inglés ""common symbiotic signaling pathway""). Más adelante en la CSSP, se inducen varios factores de transcripción y genes que funcionan en la señalización temprana específica de AM para establecer la colonización de hifas. Mediante un análisis sistemático de los fenotipos de los mutantes de leguminosas modelo (Lotus japonicus y Medicago truncatula) y arroz se identificaron los genes vegetales responsables de la transducción de señales. Los genes como SymRK, NUP85, NUP133, NENA, Castor, Pollux son necesarios para la inducción de la adición de calcio, una respuesta fisiológica distintiva durante las interacciones simbióticas tempranas. CCamK, un decodificador de señalización de calcio, y Cyclops se presentan después del aumento de calcio. En un evento posterior o paralelo, RAM1 forma un complejo con Cyclops que induce la biosíntesis de monómeros de cutina, que están involucrados en la formación del apresorio por los hongos AM. Los genes de la CSSP de arroz complementaron el fenotipo de AM en mutantes de CSSP de leguminosas, lo que indica que algunos de los componentes genéticos son similares en leguminosas dicotiledóneas y el arroz monocotiledóneo y son críticos para desencadenar procesos iniciales de simbiosis de AM. Sin embargo, trabajos recientes muestran la participación de diferentes proteínas en la transducción de la señal micorrízica de las legumbres en comparación con el arroz. Por ejemplo, tanto DELLA1 como DELLA2 en M. truncatula funcionan de manera redundante para promover el desarrollo de arbúsculos, mientras que un solo SLR1 cumple este papel en el arroz. Esta evidencia indica que existen diferencias en la transducción de señales en leguminosas en comparación con el arroz. Todavía hay una gran brecha en el conocimiento, por lo tanto, es importante delinear la transducción temprana de la señal de AM comparativamente entre las legumbres y el arroz para tener una imagen completa. Esta brecha de conocimiento queda por determinar con urgencia.
Las preguntas en el presente caso: ¿Son similares los componentes esenciales que interactúan en todos los aspectos formando AM en leguminosas y arroz monocotiledóneas? o ¿Hay variaciones o divergencias evolutivas en la transmisión de la señal en el frijol en comparación con el arroz? y ¿Cuáles son las funciones específicas de las proteínas que interactúan en el frijol y el arroz durante la simbiosis AM? Para responder a estas preguntas, se hará uso del sistema de dos híbridos de levadura para identificar las proteínas que interactúan y que participan en la CSSP de frijol y arroz. En base a este hecho, se utilizarán los genes clave de la señalización simbiótica temprana como SymRK, CCamK, Cyclops y RAM1 como cebos para identificar los genes que interactúan putativamente en bibliotecas de ADNc de raíz activada por el factor Myc de frijol y arroz. Más tarde, los nuevos genes candidatos identificados basados en interacciones fuertes en ensayos de dos híbridos de levadura se caracterizarán funcionalmente por el enfoque de desactivación CRISPR/Cas9 en raíces peludas de frijol y en mutantes de arroz (para los genes candidatos seleccionados). Se realizarán estudios sobre histología, microscopía, GST-pull down, BiFC, análisis de promotores, etc. Juntos, estos resultados identificarán genes nuevos y su rol funcional durante las interacciones de hongos simbióticos de frijol-AM o hongos simbióticos de arroz-AM.
Se espera poder publicar al menos tres artículos de investigación en revistas revisadas por pares. Tres tesis de licenciatura y una de postgrado. Una vez aceptado, el proyecto comenzará durante la primera mitad de 2021 por un período inicial de tres años. El presupuesto total para el proyecto es de $ 270 mil pesos por año.
El proyecto propuesto contribuye en tres segmentos principales.
1) Generación de nuevo conocimiento:
El proyecto de investigación propuesto tiene las siguientes cualidades para ser un proyecto innovador en el área de simbiosis.
Evidencias recientes indican que existen diferencias en la transducción de señales en leguminosas en comparación con el arroz y todavía hay una gran brecha en el conocimiento. Por lo tanto, el resultado de este proyecto cambiará nuestra comprensión actual en el área de la simbiosis micorrízica.
• Identificación de los primeros perfiles de señalización micorrízica en frijol y arroz: este proyecto identificará la lista de genes/proteínas que están involucrados en la señalización muy temprana de la MA específicamente los genes que interactúan con genes de señalización simbiótica común (SymRK, CCamK y Cyclops) y un gen clave aguas abajo (RAM1) tanto en frijol como en arroz. Esto nos permitirá interpretar cómo la transducción temprana individual varía de los dicotiledóneas y monocotiledóneas.
• Identificación de genes de señalización nuevos o comunes (genes candidatos) en el arroz y frijol y su perfil de expresión en tejidos vegetativos y reproductivos y patrones de expresión temporal durante la colonización micorrízica.
• Los perfiles de expresión espacio-temporal del promotor del gen candidato se determinarán en todas las etapas de la colonización de hongos MA en raíces peludas de frijol.
• Caracterización funcional de genes candidatos: el papel funcional de los genes candidatos durante la colonización de hongos MA en frijol utilizando el enfoque de edición de genes CRISPR / Cas9 (knockout) revelará la función de genes candidatos seleccionados. Del mismo modo, el análisis de mutantes de arroz revelará el papel de los genes candidatos durante la simbiosis de MA. Juntos, este nuevo conocimiento llenará los vacíos en la comprensión de las diferencias en la vía de señalización temprana de hongos MA entre plantas evolutivamente distintas.
• Además, este estudio estandarizará (optimización de codones) la tecnología de edición del genoma CRISPR/Cas9 en el grano de leguminosas modelo (Phaseolus vulgaris) para eliminar el gen objetivo. Este protocolo estandarizado se distribuirá entre la comunidad de investigación de P. vulgaris para un rápido crecimiento en 'estudios genéticos funcionales'.
• Este conocimiento podrá extenderse a cultivos de importancia agrícola tanto de leguminosas como de no leguminosas (arroz) para lograr una más eficiente colonización de micorriza que a su vez, favorezca e impulse un manejo sustentable de los nutrientes y el agua en los cultivos.
2) Generación de productos:
2.1 Publicaciones arbitaje
Los resultados obtenidos de este proyecto pretenden entregar al menos tres artículos de investigación en revistas de alto impacto JCR (Journal Citation Report).
1) Publicación de un artículo de revisión sobre ""Simbiosis micorrízica arbuscular en agricultura sostenible"".
2) Un artículo relacionado con la transducción comparativa de señales precoces micorrícicas en legumbres y arroz a través del análisis INTERACTOME.
3) Un artículo relacionado con el papel funcional de los nuevos genes candidatos que participan en la transducción temprana de la señal durante el establecimiento de la simbiosis micorrízica en frijol y/o arroz.
2.2 Otras publicaciones
Los resultados obtenidos en este proyecto (el primer año, segundo año y tercer año (2021-2023)) serán presentados en seis congresos nacionales e internacionales en forma de presentaciones orales y de carteles.
3) Formación de recursos humanos:
Como parte de la capacitación de recursos humanos, este proyecto permitirá el desarrollo del siguiente trabajo de tesis.
3.1 Para tres trabajos de tesis de Licenciatura
1) Ensayos de dos híbridos de levadura para identificar nuevas interacciones de proteínas en las primeras etapas de la simbiosis fúngica de MA con frijoles y arroz.
2) Clonación de genes candidatos en el vector binario CRISPR/Cas9 y producción de raíces transgénicas en frijol para validación molecular.
3) Análisis del promotor: Identificación, aislamiento y expresión espacio temporal del promotor del gen candidato en raíces transgénicas de frijol durante la interacción simbiótica con micorrizas.
3.2 Para trabajos de tesis de maestría
1) Análisis funcional de genes candidatos: análisis de fenotipos y estudios histoquímicos en las raíces peludas de las raíces mutantes de frijol y/o arroz en diferentes etapas del desarrollo de hongos MA.