Caracterización farmacológica-biofísica del canal oncogénico de potasio Kv10.1. Estudio electrofisiológico y de proliferación de células tumorales humanas

Planteamiento del problema:
En vista del papel del canal de potasio Kv10.1 en el fenotipo canceroso de células humanas por mecanismos aún desconocidos, y de las características de estructura-función únicas (no presentes en canales canónicos de K+) de Kv10.1, se plantea la necesidad de un estudio que permita determinar y caracterizar las interacciones moleculares (biofísicas) entre fármacos de uso clínico y Kv10.1 que sean relevantes para entender la relación estructura-función de dichas proteínas, y que puedan además coadyuvar a contener su papel oncogénico.

Objetivo General:
Determinar y caracterizar interacciones moleculares entre fármacos de uso clínico y los canales Kv10.1 que sean relevantes para entender la relación biofísica de estructura-función de dichas proteínas, y que puedan además coadyuvar a contener su efecto oncogénico.

Materiales y Métodos:
Se registrará la corriente de K+ total (macroscópica), de células HEK/Kv10.1 (con expression estable de Kv10.1 WT) y de células HEK transfectadas con Kv10.1 mutados, en la region correspondiente a la llamada cavidad central de canales canonicos de K+ ( F468A, y Y464A), bajo fijación de voltaje, con la modalidad de célula completa del patch-clamp. Particularmente:
a. Se realizarán curvas dosis-respuesta, a distintos voltajes, de los compuestos (desetil-amiodarona (antiarrítmico),  benzarona, benzbromarona, y 2-butil-benzofuran, todos ellos son derivados del benzofuran) de la inhibición de (a) la corriente de K+ y (b) el efecto Cole-Moore (donde haya inhibición de éste).
b. Se realizarán experimentos de competencia entre dichos compuestos contra amiodarona,  dronedarona (ambos antiarrítmicos cuya inetarcción con Kv10.1 hemos reportado), y mibefradil, en su inhibición de la corriente y del Cole-Moore, usando el plot de competencia de Cornish-Bowden (un procedimiento de cinética enzimática aplicado por vez primera a canales iónicos por nosotros (Gomez-Lagunas et al, 2017)). 
c. En caso de que haya inhibición del efecto Cole-Moore esta se estudiará en detalle cinético, empleando varias concentraciones de Mg++ (el potenciador fisiológico del Cole-Moore) y se estudiará si hay competencia o aditividad con el efecto de los compuestos.
d. Se hará un modelo cinético que describa la interacción de las moléculas estudiadas con Kv10.1
e. Se estudiará (en colaboración) el efecto de aquellas moléculas (farmacos) cuya afinidad por Kv10.1 sea alta (<5 µM) sobre la viabilidad y proliferación de células OV90 y TOV112 obtenidas de tumores epiteliales malignos de ovario de humano mediante ensayo colorimétrico.
Análisis:
Las corrientes de K+ registradas bajo fijación de voltaje se analizarán con el uso de los programas Clampfit (Axon), Sigmaplot 10 y GraphPad Prims 5 (programa tanto de graficación, y principalmente, de análisis estadístico), y se modelarán empleando MATLAB de acuerdo a lo reportado por nosotros (e.g., Meléndez et al, 2020). Los datos estadísticos incluidos los de viabilidad y proliferación cellular con el software GraphPad Prism 5.
Problemas particulares a estudiar en el Proyecto.
1. Continuar con nuestra caracterización del efecto inhibitorio de la corriente y del llamado corrimiento Cole-Moore que compuestos derivados del benzofurán (Kodama et al, 1997) ejercen sobre el canal Kv10.1 silvestre, a saber: desetil-amiodarona (estudio ya en curso), benzarona, benzbromarona, y 2-butil-benzofuran.
2. Determinar el efecto de las moléculas derivadas del benzofurán arriba señaladas, sobre Kv10.1 mutantes F468A, Y464A. Determinaremos (1) el posible cambio de afinidad en el bloqueo de la corriente de K+, (b) la dependencia del bloqueo del estado de apertura del poro y (3) el efecto de los inhibidores en la velocidad de cierre del poro. 
3. Caracterizar la inhibicion de Cole-Moore por mibefradil y amiodarona, que no ejerce dronedarona ni desetil-amiodarona (difiere de amiodarona en un grupo etilo): determinar el efecto de Mg++ sobre la inhibición de amiodarona y mibefradil; (b) determinar la dosis respuesta de la inhibición del Cole-Moore y comparar contra la inhibición de Ik; (c) determinar si las mutantes permiten separar la inhibición del poro de la del efecto Cole-Moore; (d) realizar un ensayo de competencia entre amiodarona y mibefradil en su inhibición del Cole-Moore. (e) determinar el efecto de la delecion N-terminal 7-12 de PAS en la inhibicion de Cole-Moore.
4.Analizar el efecto de los farmacos sobre tumores de ovario (colaboración Dra. Carmen Mendez)